Esta entrada fue escrita el dia Domingo, abril 17th, 2011 a las 4:42 en la categoria Biotecnología. Ud. puede seguir las respuestas a través de RSS 2.0. Ud. puede escribir sus comentarios, o agregar el post a su propio sitio web.
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Producción de estreptolisina-O recombinante
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- Muchos laboratorios en distintas partes del mundo han desarrollado reactivos para determinar el título de anticuerpos anti-estreptolisina-O (SLO) en suero humano. Esto se debe a que la determinación de anticuerpos anit-SLO es el test de laboratorio más usado para el diagnóstico de las complicaciones causadas por la infección de Estreptococcus pyogenes.
Muchos de estos ensayos están basados en la aglutinación de partículas de látex adsorbidas con SLO, que cuando son enfrentados a muestras de suero que contienen cierta concentración de anticuerpos anti-SLO, aglutinan. La visualización de esta aglutinación se efectúa a simple vista en portaobjetos y en los últimos años, la utilización de métodos basados en la dispersión de luz tales como nefelometría y turbidimetría, han permitido la utilización de autoanalizadores y la automatización de los ensayos.
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Para la producción de estos reactivos es necesario el empleo de cantidades importantes de SLO altamente purificada. Esta exotoxina bacteriana contiene 571 aminoácidos de los cuales los 31 primeros del extremo N-terminal pertenecen al péptido señal que permite la secreción de la proteína al medio extracelular a través de la membrana citoplasmática bacteriana. En los sobrenadantes de cultivos de S. pyogenes se encuentra en proporción variable la forma A de 540 aminoácidos y la forma B de 494 aminoácidos. Estas formas moleculares de SLO son resultado de proteólisis por la cisteín proteasa de estreptococo, entre los residuos Lys-77 y Leu-78, siendo esta proteasa producida en concentración variable de acuerdo al pH del medio de cultivo; teniendo ambas formas moleculares similar actividad hemolítica.
La producción de SLO, a partir de sobrenadante de cultivo de S. pyogenes, es problemática, debido a que el rendimiento es bajo, requiriendo además condiciones de crecimiento estrictas. Por otra parte, el proceso de purificación de esta toxina es muy largo y complejo, por la dificultad de separar el producto deseado de las proteínas procedentes del medio de cultivo así como de otras proteínas secretadas por el microorganismo. Sumado a ello, la degradación rápida de SLO producida por la cisteín-proteasa durante la recuperación de la misma, es otro factor que dificulta el proceso de purificación, dando como consecuencia un sistema productivo costoso, poco apropiado para la aplicación a nivel industrial. En el caso particular de la producción de SLO llevada a cabo por compañías productoras de reactivos de inmunodiagnóstico, si bien la misma puede obtenerse como subproducto de la producción de estreptoquinasa por S. pyogenes, ésta no es una alternativa adecuada. Esto es debido a que para obtener niveles apropiados de SLO, es necesario previamente seleccionar cepas que sean altamente productoras de esta exotoxina para lograr un producto de mejor calidad con buenos rendimientos.
Según la empresa española Biokit S.A, mayor productora a nivel internacional de SLO, a principios del 2000 la demanda de la producción de SLO tuvo una media de 50.000 litros de cultivo de S. pyogenes aproximadamente por año. El manejo de grandes volúmenes de cultivo de S. pyogenes representa un problema de bioseguridad, ya que estos microorganismos son patógenos humanos, sumado al complejo esquema de purificación de SLO, ha motivado que tanto esta compañía como otras, estén desarrollando nuevas estrategias para la producción de SLO.
Con el fin de solucionar los problemas asociados a la producción de esta molécula, se están empleando técnicas de ingeniería genética, usando diferentes sistemas de expresión. Esta alternativa permitiría lograr mayor rendimiento de producción de proteína recombinante, simplicidad en los sistemas de purificación frente a los esquemas de purificación tradicionales, proporcionando además mejora en la bioseguridad del proceso en la planta de producción. Esto trae como consecuencia una mayor productividad, mejor reproducibilidad lote a lote, facilidad de producción y reducción de residuos de difícil eliminación, lográndose disminución en los costos del producto. Por tales motivos la producción de SLO recombinante, es considerada por las empresas productoras de productos biológicos, estimándose que en los próximos años, la producción de la molécula recombinante sustituirá definitivamente a la molécula nativa.
En tal sentido, en el Departamento de Desarrollo Biotecnológico del Instituto de Higiene de la Facultad de Medicina (Universidad de la República, Uruguay) se trabajó en un proyecto para la obtención de estreptolisina-O recombinante en vista a la producción para su aplicación en diagnóstico.; obteniéndose un protocolo de producción con un rendimiento 30 veces superior al protocolo tradicional de obtención a partir de cultivos de S. pyogenes. Debe destacarse que la estreptolisina-O recombinante obtenida conservó su actividad hemolítica y antigénica.
Esto supone un importante avance, pues las complicaciones de la infección por S. pyogenes no es un tema aún resuelto, sobretodo en Latinoamérica. Las mejoras que puedan lograrse en la obtención de una de las moléculas más usadas en el diagnóstico de estas complicaciones supone no sólo mejoras en el proceso productivo, con mayores rendimientos y esquemas más sencillos de producción, con una reducción de costos en los kits de diagnóstico a mediano plazo, junto con una mejora sustancial de bioseguridad para el personal que trabaja en la industria.Autor: Blanca Velázquez
Este artículo está basado en el trabajo de tesis efectuado por la autora para la obtención del título de Magíster en Biotecnología: “Producción de estreptolisina-O recombinante para uso diagnóstico” (Facultad de Ciencias, Universidad de la República).
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