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Cuando se desea expresar genes en huéspedes heterólogos es frecuente encontrarse con el hecho de que la proteína recombinante se degrade, con lo que se obtiene bajo rendimiento de proteína en adecuadas condiciones. Una de las maneras de solucionar este problema, consiste en lograr proteínas híbridas, o sea fusionadas junto con la proteína heteróloga de interés. Esta unión es covalente, de modo que sea estable que no sea “atacada” por proteasas del húesped.

Para conseguir estas proteínas de fusión, hay que hacer una construcción genética en la que se une, manteniendo el marco abierto de lectura adecuado, el gen de la proteína a fusionar, por ejemplo, un gen del huésped, con el gen que queremos expresar.

A modo de ejemplo, destacaremos en forma breve las características más importantes de un vector especializado para obtener proteínas de fusión en Escherichia coli que queden expuestas al exterior desde la membrana externa:

1- Porción terminal 5’ del gen ompF que codifica una proteína de membrana externa. Este segmento suministra las señales de comienzo de la transcripción y de la traducción, así como las señales para que la proteína se exportada hasta la membrana externa.
2- Luego, en la construcción genética, poner a continuación una versión truncada del gen lacZ, desprovista no solo del promotor, sino carente de los codones correspondientes a los ocho primeros aminoácidos. En este caso, si se hiciera de este modo, se podría sintetizar b-galactosidasa funcional en el caso de estar en fase la secuencia que acabamos de describir. Otra característica de este lacZ es que su proteína es capaz de funcionar incluso cuando está fusionada en su extremo amino-terminal con otra proteína.
3- La situación relativa entre el extremo 5’ del ompF y el gen modificado de lacZ en el vector original es tal que este último no está en fase correcta. Por lo tanto, el vector no codifica b-galactosidasa.
4- Sin embargo, si se clona un gen entre ompF y lacZ de modo que todos queden en fase, se producirá una proteína “tri-híbrida” consistente en el extremo de OmpF fusionado con nuestra proteína, que a su vez va fusionada con la b-galactosidasa. Los clones recombinantes que sinteticen esta proteína tri-híbrida se pueden identificar fácilmente porque tienen actividad b-galactosidasa, detectable como colonias azules en placas provistas de galactósido artificial cromogénico X-gal.

Esta proteína tri-híbrida se puede usar para dos fines principales: Como antígeno para producir anticuerpos frente a la porción proteica que se exprese con el gen clonado o como medio para aislar pequeñas porciones importantes de la proteína recombinante de interés.

Para el caso de la expresión de proteínas recombinantes en levaduras, puede usarse Flag. Este se puede comprar a una empresa en forma del vector, previsto para su uso en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Este elemento Flag determina un péptido de ocho aminoácidos, cuya secuencia son Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys.

A modo de ejemplo, si deseamos expresar en levadura el gen de la interleucina 2 (IL-2), una citoquina de gran valor terapéutico; se debería insertar dicho gen a continuación del elemento genético de Flag. La levadura recombinante produce y secreta la proteína híbrida, que no se degrada. Por otro lado, el péptido Flag nos va a facilitar la tarea de purificar en un solo paso la proteína de interés, por cromatografía de afinidad:

En este caso se prepara una columna cromatográfica a base de un soporte sintético (como polipropileno) al que se une anticuerpo monoclonal específico frente al péptido Flag. Se hace pasar el extracto o sobrenadante de la cepa recombinante por la columna. La proteína híbrida de interés quedará retenida, al unirse con el anticuerpo, mientras que las restantes pasan de largo. Para eluir la proteína recombinante, se lavará la columna con un tampón bajo en calcio. Aunque la IL-2 recombinante provista de los 8 aminoácidos de Flag en su extremo N-terminal es funcional, las autoridades sanitarias obligan a eliminar ese péptido. Para ello se trata a la proteína híbrida con una proteasa específica, tal como la enteroquinasa intestinal bovina.

Si bien, la utilización de construcciones moleculares para expresar proteínas recombinantes fusionadas a otra proteína con el fin de mejorar su estabilidad y conformación tridimensional, y por ende, que la misma sea funcional, debe resaltarse que para fines terapéuticos, los estándares de calidad exigen que estas proteínas deben ser despojadas de las porciones del elemento de fusión. Por ello, los elementos de fusión suelen ser secuencias reconocidas por proteasas específicas que cortan en la unión entre dicho elemento y la proteína de interés, sin que esta última se vea afectada por la acción enzimática.