Construcción de Promotores para expresión proteica

Como tendencia general, en principio, se podría pensar que si quisiera expresar un gen con alto rendimiento de producción se debería escoger un promotor fuerte y constitutivo. Sin embargo, la mayoría de las veces, este tipo de promotores no aporta el efecto deseado debido a que al estar expresándose permanentemente el gen de interés a alto nivel, pueden sustraerse recursos para el normal crecimiento de las células.

Esto es especialmente importante si la proteína foránea tiene efectos negativos para el huéped. Por lo tanto, lo recomendable es emplear promotores regulables, que el investigador puede “conectar y desconectar” a voluntad.

Una estrategia común es cultivar la bacteria recombinante hasta que se logra una concentración celular adecuada y entonces recién en esa etapa suministrar la señal para que el promotor se active y transcriba el gen insertado.
Generalmente los promotores regulables de Escherichia coli que se emplean en los vectores de expresión más habituales son promotores fuertes pero que están, en determinadas condiciones, reprimidos por las correspondientes proteínas represoras, lo que suministra la base para inducir el gen adyacente cuando sea necesario.

El promotor del operón de la lactosa (lac) ha servido para diseñar elementos de control de expresión en numerosos vectores. Mientras en el medio no exista lactosa (o un inductor apropiado), el promotor está reprimido por el represor (producto del gen lacI). En el laboratorio, la inducción se suele lograr añadiendo al medio un inductor que a diferencia de la lactosa, no se metaboliza, pero se une al represor, inactivándolo. Ejemplo de este tipo de inductor es el IPTG (isopropil-b-D-tiogalactósido). Para que el promotor lac se exprese a alto nivel, se deberá evitar la represión catabólica. Esto es que en ausencia de glucosa la proteína CAP se une con AMPc, y el complejo se une cerca del promotor, ayudando a la ARN polimerasa a comenzar la transcripción.
Para el caso particular de los vectores de expresión, se suele emplear un promotor lac mutante, conocido como lacUV5 (con una sustitución en la región –10), que es más potente que el promotor silvestre. Claro esta que esta variante es reprimible por LacI e inducible por IPTG.

Para el caso del operón trp éste contiene los genes estructurales que determinan las enzimas para la síntesis del triptófano. Su promotor es reprimido en presencia de triptófano en el medio, por el complejo represor-triptófano. Sin embargo, si no hay triptófano disponible, el represor queda inactivo, y por lo tanto el operón trp se transcribe. En los vectores basados en el promotor trp, la expresión se logra empleando medio de cultivo sin triptófano, mientras que se reprime en presencia de dicho aminoácido, o añadiendo en su lugar ácido 3-indol-acrílico.

Mediante el diseño de un “promotor artificial”, tal es el caso del promotor tac (el cual se obtuvo combinando la región –35 del promotor trp y la región –10 del promotor lac); se logró obtener un promotor 5 veces más potente que el de trp y 10 veces más que el de lac. Este promotor artificial, a similitud del promotor de lac, es inducible por IPTG y reprimido por glucosa. Es frecuente su uso en vectores de expresión de alto rendimiento; lográndose alcanzar niveles expresión de proteína recombinante entre 10-30% del total de proteína expresada.

También se puede usar un sistema de expresión regulable consistente en el promotor PL del fago lamda y su represor cI. En la práctica se recurre al represor mutante cI857, que es un mutante termosensible (ts). De esta manera, se puede cultivar la bacteria recombinante a una temperatura moderada, por ejemplo a 28-30ºC a lo que el represor impide la transcripción del gen de interés. Cuando el cultivo alcanza la densidad celular deseada, se sube la temperatura hasta 42ºC, de modo que inactiva al represor y se logra la expresión a alto nivel del gen deseado desde el promotor PL.

El promotor del fago T7 necesita la ARN polimerasa específica del mismo fago. Por lo tanto si se desea expresar genes bajo ese promotor, hay que clonar simultáneamente el gen de la polimerasa de T7. Normalmente este gen de la polimerasa se inserta en el cromosoma de E. coli o en el profago lamda (la versión insertada del cromosoma del lamda en las células lisogénicas) y bajo el control del promotor de lac. Acto seguido, se procede a transformar las células con la construcción genética dotada del gen de interés “downstream” del promotor del T7. Cuando se añade el inductor IPTG, se induce el gen de la polimerasa de T7, proteína que transcribe a gran nivel el gen clonado.

Ejemplo de construcción de un plásmido de expresión de alta eficiencia

El plásmido pPLc2833 era ya un buen plásmido de expresión, sin embargo, mediante modificaciones moleculares se puede construir a partir de él, un plásmido con mayor capacidad de expresión.
El pPLc2833 cuenta con un módulo pensado para clonar genes bajo el control del promotor PL del fago lamda: tras el PL existe un polilinker, es decir, un trecho de ADN dotado de múltiples dianas únicas para las respectivas enzimas de restricción (lo que permite usar cada vez la enzima más adecuada a nuestro experimento). Este plásmido presenta unas 40 copias por cromosoma. Para lograr una expresión a mayor nivel, se sustituyó su origen de replicación por el origen de replicación de otro plásmido, llamado pKN402, de modo que el número de copias se puede aumentar unas 8 veces incubando la bacteria a 42ºC. De esta forma se obtuvo el plásmido mejorado pCP3. Para su uso correcto, las células que albergan derivados de pCP3 con genes clonados bajo el promotor PL se cultivan primero a 28ºC, y una vez alcanzada una buena densidad celular, la temperatura es subida hasta 42ºC, con lo que el número de copias sube hasta unas 700. A esa temperatura, el represor termosensible cI(ts) se inactiva, por lo que el promotor PL funciona a su máximo rendimiento, y se logran altos niveles de la proteína codificada por el gen clonado.
Para hacerse una idea de la eficiencia de este sistema de expresión, baste decir que cuando se clonó el gen de la ligasa de T4 en el pCP3, el 20% de la proteína total a 42ºC era ligasa de T4.

El uso de promotores que se activan al bajar la temperatura presenta la ventaja de que la proteína se pliega mejor, con lo que se evitan los problemas de la formación de cuerpos de inclusión. El promotor mejor caracterizado es el de cspA, aunque tiene el incoveniente de que se inactiva al cabo de 1-2 horas, un tiempo muy corto para trabajar en cultivos en fermentadores.
Sin embargo, actualmente ha recibido atención el sistema de la arabinosa. Este sistema usa el azúcar arabinosa, que es un azúcar muy económico, siendo la eficiencia del promotor de araBAD más débil que la de los lac.

Lecturas recomendadas:

Construction and model-based analysis of a promoter library for E. coli: an indispensable tool for metabolic engineering.BMC Biotechnol. 2007 Jun 18;7:34.
A new systematic computational approach to predicting target genes of transcription factors.Nucleic Acids Res. 2007;35(13):4433-40. Epub 2007 Jun 18.
General pathway for turning on promoters transcribed by RNA polymerases containing alternative sigma factors.J Bacteriol. 2006 Jul;188(13):4589-91.
Transcription in four dimensions: nuclear receptor-directed initiation of gene expression. EMBO Rep. 2006 Feb;7(2):161-7.

3 Respuestas to “Construcción de Promotores para expresión proteica”

  1. Buen días:

    Me gustaría conocer que ocurre en la fusión del operón trp con el operón lac, sólo queda la región regulatoria trp. ¿Sólo se debe tener en cuenta la influencia sobre el operon trp?

    Gracias

  2. Estimada Karen:

    El promotor tac combina la región ­-35 del promotor trp y la -­10 del promotor lac. Es un promotor híbrido. Este promotor es inducido por IPTG y reprimido por la glucosa.
    Si deseas más información general te recomiendo un clásico de la biología celular: “Genes”. Además en el artículo se recomiendan algunos artículos que pueden ser útiles.

    Atentamente

  3. Me gustó el artículo. Quisiera conocer como prodría construir un promotor fuerte para la expresión del gen de estudio en células mamífereas.
    En el caso concreto que me puede ser útil es repetir la sequencia del promotor (-1 a -118) en más de una ocasión (-1 a -118)x 4
    Agradecería la ayuda
    Fernando L.

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